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倫地西韋介紹

   日期:2020-02-01     瀏覽:46    評論:0    
核心提示:摘要新興的病毒感染難以控制,因為異類成員會定期循環進出人類和人畜共患病宿主,這使特定抗病毒療法和疫苗的開發變得復雜。冠狀

摘要
新興的病毒感染難以控制,因為異類成員會定期循環進出人類和人畜共患病宿主,這使特定抗病毒療法和疫苗的開發變得復雜。冠狀病毒(CoV)具有迅速傳播到新的宿主物種中并導致嚴重疾病的傾向。SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒相繼出現,在全球免疫純稚的人群中引起嚴重的流行性呼吸道疾病。能夠抑制冠狀病毒感染的廣譜療法將解決當前未滿足的醫療需求,在新興和地方性冠狀病毒感染的治療中可能具有不可估量的價值。在這里,我們顯示了核苷酸前藥GS-5734(目前正在臨床開發中,用于治療埃博拉病毒病),50個值。GS-5734對蝙蝠冠狀病毒,大流行前的蝙蝠冠狀病毒和主要人肺細胞中循環的當代人類冠狀病毒也有效,因此證明了廣譜抗冠狀病毒活性。在SARS-CoV發病機理的小鼠模型中,GS-5734的預防性和早期治療性給藥顯著降低了肺病毒載量,改善了疾病以及呼吸功能的臨床體征。這些數據提供了實質性證據,表明GS-5734可能被證明可有效抵抗中東地區的流行性MERS-CoV,流行的人類CoV,甚至最重要的是可以預防未來出現的CoV。

介紹
遺傳上不同的冠狀病毒(CoV)家族目前由四個基因組組成:1(α),2(β),3(γ)和4(δ),可感染鳥類和多種哺乳動物。迄今為止,僅已知冠狀病毒組1和2感染人類。盡管冠狀病毒復制機制顯示出實質性的校對活性,但病毒基因組RNA的復制本質上容易出錯,從而推動了遺傳相關但種類多樣的準種的存在(1)。大多數CoV菌株的寄主范圍狹窄,但人畜共患的CoV傾向于進入新的寄主物種(2)。嚴重的急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)是新出現的冠狀病毒的最新例子,這些冠狀病毒在免疫純樸的人群中引起了嚴重的疾病。SARS-CoV于2002年在中國廣東出現,并借助商業航空旅行在全球迅速傳播,造成8000多例病例,死亡率為10%(2)。2012年,人們發現MERS-CoV通過中間駱駝宿主從蝙蝠感染人類,在27個國家/地區造成1700多例病例,死亡率接近40%,就像SARS-CoV航空旅行一樣,全球傳播已蔓延至二十七個國家(2)。MERS冠狀病毒在中東和血清學研究在沙特阿拉伯和肯尼亞的英國流行表明,在人類中相當頻繁的感染(>有45,000人)(3,4)。SARS-CoV流行病已于十年前結束,但已從蝙蝠中分離出數種SARS樣CoV,這些蝙蝠可有效利用人類血管緊張素轉化酶2(ACE2)受體,在原代人氣道細胞中復制至高滴度,并且對現有的治療方法有抵抗力抗體和疫苗(5,6)。隨著人類和野生動物生態系統的重疊越來越多,新穎的冠狀病毒出現在人類中的潛力很大(2)。能夠抑制已知人類冠狀病毒的廣譜冠狀病毒療法將解決眼前未滿足的醫學需求,并且在將來出現新型冠狀病毒的情況下可能是無價的治療方法。
當前,尚無批準的針對人類冠狀病毒的特定抗病毒療法。嘗試使用已批準的抗病毒藥(例如,利巴韋林,洛匹尼韋-利托那韋)和免疫調節劑(例如,皮質類固醇,干擾素等)治療SARS和MERS-CoV患者在隨機對照試驗中均無效(7)。即使存在幾種保守的可藥物修飾的CoV酶靶標,包括3CL蛋白酶,PL蛋白酶和NSP12復制酶,有效的CoV特異性直接作用抗病毒劑(DAA)的臨床開發仍難以捉摸。(7)。2016年,沃倫(Warren)等人。等人報道了腺苷類似物GS-5734的小分子單磷酸氨基磷酸酯前藥對非人類靈長類動物的埃博拉病毒的體內抗病毒功效(8))。由于GS-5734對埃博拉病毒的作用機制(MOA)是抑制病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),并且先前的工作表明GS-5734的核苷組分對SARS-CoV的活性較弱(9) ,我們試圖評估GS-5734對多種人類和人畜共患CoV的抗病毒效力和活性廣度。

結果
GS-5734可防止SARS和MERS-CoV在人氣道上皮細胞中復制
GS-5734是一種前藥,需要宿主細胞將其代謝為藥理活性的三磷酸酯(TP),以抑制病毒復制(9)。為了確定GS-5734是否可以抑制高致病性人冠狀病毒的復制,我們首先評估了連續人肺上皮細胞系Calu-3 2B4(2B4)(10)的抗病毒活性和細胞毒性。GS-5734抑制2B4細胞中的MERS-CoV復制,平均最大有效濃度(IC 50)值為0.025μM(圖1A和S1)。重要的是,在濃度高達10μM時,我們沒有觀察到任何可測量的細胞毒性(圖1B和S1),從而證明GS-5734 的50%細胞毒性濃度(即CC 50)在2B4細胞中超過10μM(CC 50 / IC 50 =治療指數> 400)。通過孵育1μMGS-5734,在48小時的治療過程中,Calu-3-2B4中GS-5734的藥理活性TP的平均細胞內濃度為2.79μM(圖1C)。兩者合計,這些結果表明,在肺中低微摩爾濃度的TP時,將實現CoV復制的顯著抑制。

圖1
GS-5734在2B4細胞中的MERS-CoV抗病毒功效,毒性和代謝
人肺氣道上皮細胞(HAE)的原代培養是肺中生物學上最相關的體外模型之一,概括了人氣道的細胞復雜性和生理學(11)。我們評估了HAE培養物中GS-5734對SARS-和MERS-CoV的抗病毒活性。與平均IC 50為50的未處理對照(圖2A和B)相比,在0.1μM時觀察到劑量依賴性復制的減少接近1 log 10,在1μM時超過2 log 10(GS-5734 )值分別為0.069μM(SARS-CoV)和0.074μM(MERS-CoV)。同時,我們通過定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(qRT-PCR)評估了細胞內基因組(ORF1a)和亞基因組病毒RNA(ORFN)的豐度。對于SARS-和MERS-CoV,ORF1a和ORFN均呈劑量依賴性降低(圖2C和D),與效價降低一致。如通過顯微鏡觀察到的,隨著GS-5734劑量的增加,被MERS-CoV感染的HAE細胞的數目也減少了(圖2E)。為了評估GS-5734在HAE中的細胞毒性,我們首先測量了兩種不同死亡受體TNF和FAS的信號級聯反應中多種促凋亡和抗凋亡因子的轉錄水平(圖S2A和B)。與陽性對照藥物星形孢菌素不同,它可以統一上調所測量的所有凋亡因子的轉錄,在抑制CoV復制的濃度下,我們沒有觀察到GS-5734治療的劑量依賴性作用。然后,我們通過CellTiter-Glo測定法在用10μM或0.1μMGS-5734或DMSO處理48小時的HAE中測量了細胞毒性。不出所料,GS-5734的治療與DMSO相似(圖S2C,HAE中的CC50> 10μM,治療指數> 100)。為了評估GS-5734在其他主要人類肺細胞類型中的細胞毒性,我們將正常人的細支氣管上皮(NHBE)細胞培養物暴露于GS-5734或兩種已知細胞毒性化合物嘌呤霉素或星形孢菌素的稀釋液中(圖S3)。在NHBE中,平均CC 50GS-5734的M50被確定為45μM,比2B4細胞中MERS-CoV的IC 50值(0.025μM)高1800倍,比HAE中MERS-CoV的IC 50值高600倍細胞(0.074μM)(圖S3A和B)。在一起,我們證明了在HAE中針對SARS-和MERS-CoV的抗病毒功效,其濃度至少比具有可觀察到的細胞毒性的濃度低100倍。

圖2
GS-5734可防止SARS和MERS-CoV在人氣道上皮細胞中復制
GS-5734可有效對抗HAE中各種人類和人畜共患的冠狀病毒
CoV宿主特異性和進入宿主細胞的過程受病毒刺突糖蛋白(S)的指導,其廣泛的遺傳變異反映了宿主物種的多樣性和病毒受體使用的變異(圖3A)。相反,CoV RdRp nsp12在CoV之間特別是在基因組內高度保守(圖3A),使其成為可能廣泛應用的藥物靶標。

圖3
GS-5734可有效對抗HAE中各種人類和人畜共患的冠狀病毒
由于我們觀察到了對基因組2的兩個成員(SARS-和MERS-CoV)的抗病毒作用,因此我們試圖評估針對HAE細胞中人類和人畜共患的蝙蝠CoV的遺傳多樣性陣列的抗病毒活性的廣度。與HAE處理培養物GS-5734感染冠狀-NL63,循環組1周的人冠狀病毒,其通常導致支氣管炎(12),產生了顯著的3個對數10在病毒生產在0.1μM和在更高的濃度檢測不到病毒減少(圖3B)。同樣,GS-5734處理抑制了非常多樣的SARS-CoV樣組2b(HKU3,WIV1和SHC014)和MERS-CoV樣組2c(HKU5)蝙蝠冠狀病毒的復制。在這些之中,WIV1和SHC014問題特別大,為“大流行前菌株”,它可以感染HAE培養物,而不適應,并因此,在人類中(蓄勢出現5,6)。使用1μMGS-5734,蝙蝠冠狀病毒的傳染性病毒產量降低了1.5-2 log 10,病毒基因組和亞基因組轉錄物的水平降低了1-2 log 10(圖3B)。總之,這些數據表明,GS-5734可以抑制多種多樣的CoV,包括循環的人,人畜共患的蝙蝠CoV和大流行前人畜共患的CoV。
GS-5734預防性治療可減少SARS-CoV疾病
GS-5734在小鼠中的血漿穩定性相對較差(即半衰期<5分鐘),這是由于人體中不存在分泌型羧酸酯酶1c(Ces1c)的表達所致(13)。GS-5734的血漿穩定性在基因缺失Ces1cCes1c -/-)的小鼠中顯著增加(半衰期?25分鐘,圖S4)。我們證實,通過體重減輕和肺病毒滴度測量的SARS-CoV發病機理在野生型(WT)C57BL / 6J和Ces1c -/-小鼠中都是通過感染這兩種菌株的年齡和性別匹配的小鼠而相似的(圖S4))。然后,我們評估了Ces1c中的藥代動力學(PK)譜-/-每天一次(QD)皮下注射(sc)50毫克/千克或每天兩次(BID)注射25毫克/千克的小鼠。前藥的血漿濃度迅速降低,并伴隨著短暫暴露于丙氨酸代謝產物(Ala-Met)和更持久地暴露于核苷類似物(圖4A)。酯酶缺乏癥小鼠的血漿PK曲線與先前在猴子中報道的相似(8),但是代謝物在小鼠體內的組織蓄積效率卻降低了約10倍,這表明高劑量和相應的血漿暴露對于獲得與人類預測的肺TP水平相似是必需的。肺中的代謝物譜顯示TP是主要的細胞內代謝物,建立了總肺代謝物水平作為TP的近似值的技術難度較小的評估(圖4B)。盡管50mg / kg的QD和25mg / kg的BID均可達到目標最大肺水平,但組織激活不僅在小鼠中效率較低,而且TP相對于所觀察到的小鼠在肺中的半衰期(?3hr)明顯縮短。在體外人類肺細胞或體內非人類靈長類動物肺中存活(半衰期約20小時;圖S5)。因此,只有BID給藥方案才能將肺水平維持在與人類預期水平一致的12至24小時之間,并且足以在給藥間隔內維持CoV抑制作用(圖4C)。

圖4
GS-5734在Ces1c -/-小鼠中的藥代動力學
小鼠SARS-CoV疾病模型忠實地概括了人類SARS-CoV發病機制的許多方面,包括厭食癥,高滴度的病毒在肺中復制,急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發展以及與年齡相關的疾病加重(14)。如圖圖5A中,預防性施用每天一次,在50毫克/公斤或每天以25mg / kg的改良后的SARS-CoV的誘導的體重減輕用媒介物治療看到兩次。與媒介物對照動物相比,經GS-5734處理的小鼠,肺臟病毒滴度在2和5 dpi時均顯著降低(P <0.05)(圖5B))。另外,與用媒介物處理的動物相比,用GS-5734處理的動物的肺部中的病毒抗原染色水平顯著降低(P <0.05)(圖5C和D)。與媒介物治療的動物相比,GS-5734的治療還減少了SARS-CoV誘導的肺部病理,包括裸露的毛細支氣管炎,炎性浸潤的血管周圍蓄積(即“套囊”)以及與彌漫性肺泡損害相關的肺泡內水腫(圖5E)和S6)。

圖5
GS-5734預防性治療可減少SARS-CoV疾病
通過全身體積描記法(WBP)進行的測量,使用GS-5734進行的預防性治療可防止在SARS-CoV感染的媒介物治療的動物中出現肺功能缺陷,這是定量肺功能的一種極為靈敏的方法(15)。Penh是氣道阻力或氣道中碎屑堆積的替代指標,與用GS-5734處理的動物相比,在媒介物處理的動物中顯著提高(P <0.05)(圖5F)。與給予GS-5734的動物相比,用媒介物處理的動物增加了呼吸困難的度量標準,例如呼氣時間增加和在一次呼吸結束與下一次呼吸開始之間延長的停頓時間(圖5F)。
GS-5734的暴露后治療性治療可減輕疾病
由于GS-5734的預防性給藥減少了病毒的肺滴度,改善了肺功能并改善了SARS-CoV疾病的癥狀,因此有興趣確定治療方法是否也有效。首先,我們比較了從-1 dpi(即預防性)或+1 dpi(即治療性)開始的25 mg / kg GS-5734 BID的抗病毒功效。GS-5734的治療方法大大降低了SARS-CoV引起的感染動物體重減輕(圖6A和B),并顯著抑制了病毒的肺滴度(P = 0.0059),從而證明了GS-5734的治療方法可以減少疾病并抑制復制持續的感染(圖6C)。重要的是,與用賦形劑治療的對照相比,治療顯著(P = 0.003)改善了肺功能(即降低了Penh評分)(圖6D)。然后,我們探索了給定2dpi的GS-5734的治療潛力,這是在病毒復制和肺氣道上皮損傷達到峰值后得出的(圖S7)。疾病的嚴重程度和存活率與治療無差異,但我們觀察到在6dpi時,GS-5734處理的動物的SARS-CoV肺滴度顯著降低(P <0.05)。這些數據表明,在達到疾病的免疫病理學階段后,達到最高肺滴度后病毒載量的減少不足以改善結局。因此,在小鼠中,如果在SARS-CoV復制高峰和氣道上皮峰值損害之前給予,GS-5734可以改善肺功能,減少病毒載量并減少疾病。

圖6
GS-5734的暴露后治療性治療可減輕疾病

討論


由于通常缺乏特定的抗病毒療法和疫苗,因此新興的病毒感染代表著全球健康的關鍵問題。為了最大程度地發揮針對新興病毒的療法的潛在公共衛生利益,它們應有效應對過去(即SARS-CoV),當前(即MERS-CoV)和未來出現的病毒威脅。了解治療效果的頻譜對于做出明智的臨床決策(尤其是在疾病爆發的早期階段)至關重要。由于人畜共患牛冠狀病毒的出現是由人類,野生動物和病毒因素的混合驅動的,因此僅基于病毒基因組序列就很難評估人畜共患牛冠狀病毒的出現潛力(2))。在本手稿中,我們提供了一個成功的公私合作示例,該合作伙伴結合了宏基因組學,合成生物學,主要的人類細胞培養模型,藥物代謝,藥代動力學和病毒發病機理的體內模型,以證明候選藥物的廣譜活性針對易于出現的病毒家族(圖S8)。盡管我們展示了針對多種CoV基因組的人類和人畜共患CoV的廣譜功效,但我們尚未評估所有CoV基因組的抗病毒功效,這是我們當前研究的局限性。然而,我們的人類和人畜共患蝙蝠CoV重建小組對于確定GS-5734是否能有效對抗高度趨異的新出現(SARS-CoV),正在出現的(MERS-CoV)和具有大流行潛力的循環人畜共患病菌株(即WIV1,SHC014)至關重要)(5,6,16,17)。未來,新興病毒的疫苗,療法和診斷方法的快速發展將取決于實驗室中這些病毒的重建以及體外和體內適應性。


在這里,我們報告了一個小分子在體外和體內對多種遺傳上不同的冠狀病毒的廣譜抗病毒功效。目前的疫苗和人單克隆抗體的方法已被證明是有效的,但典型地具有保護的有限寬度由于冠狀病毒S糖蛋白(抗原的多樣性5,6)。相反,由于CoV復制酶固有的遺傳保守性,靶向GS-5734的RdRp療法更可能廣泛對抗過去,現在和將來的CoV。核苷前藥balapirivir無法將小鼠和人類的體外功效轉化為體內功效所證明的那樣,應在最生物學相關的發病機理模型中全面評估抗病毒藥物的候選藥物,以最大程度地提高臨床可翻譯性(18)。核苷類似物的主動轉運和/或代謝中細胞類型的特異性差異可能會影響抗病毒譜(19)。因此,我們的目標是擴大以前僅限于猴腎癌細胞系的SARS和MERS-CoV抗病毒功效的體外研究(8,9)。HAE細胞培養物在細胞復雜性和生理學上與人的氣道相似,包含分泌粘液的細胞,基底外側細胞以及SARS-CoV(纖毛上皮細胞)和MERS-CoV(非纖毛上皮細胞)的一些主要靶細胞)體內(11,20)。利用我們的HAE細胞抗病毒功效數據,我們提供了有力的證據表明GS-5734將在人肺中多種人源和人畜共患的冠狀病毒靶向的細胞中被吸收和代謝。


臨床前體內抗病毒功效研究提供了對藥物的藥代動力學-藥效學(PK / PD)關系的真知灼見,可從中推論出有效的給藥方案用于人類臨床試驗。為了最大程度地利用臨床前PK / PD研究,必須使用能夠準確概括人類疾病的動物模型。本文所用的小鼠適應性SARS-CoV(SARS-CoV MA15)模型捕獲了人類疾病的多個方面,包括僅限于肺的高滴度病毒復制,ARDS的形成,與年齡相關的疾病加重和死亡。與感染SARS-CoV的人的病毒滴度在癥狀發作后7-10天達到峰值相比,SARS-CoV MA15感染的C57BL / 6小鼠肺部的病毒滴度迅速增加4-5個對數,并在2dpi時達到峰值,14)。2dpi后,病毒滴度逐漸減弱,其余的病程由免疫病理學驅動。因此,人類復制高峰前7-10天被壓縮到我們小鼠模型的前48小時內。與人類相似,在SARS-CoV的感染小鼠的疾病嚴重程度與肺病毒載量,它可以通過輸入病毒(的劑量增加被調制直接相關14,21)。使用GS-5734的預防性和治療性(+ 1dpi)劑量,我們證明復制減少到低于致病閾值。從2dpi開始的治療降低了肺病毒載量,但并未改善疾病的預后,這表明在病毒復制和免疫病理學達到臨界點后開始的抗病毒藥物在臨床上無益。考慮到流感抗病毒藥物奧司他韋的先例,該結果并不令人驚訝,在奧賽他韋中,癥狀發作后隨著時間的推移治療效果會逐漸降低(22)。像SARS-CoV一樣,癥狀出現后第二周,呼吸道的MERS-CoV滴度達到峰值(23)。因此,與實驗感染的小鼠相比,在人類出現癥狀后但在達到病毒滴度達到峰值之前進行抗病毒治療的時間應延長。不幸的是,以上提到的小鼠和人類在SARS-CoV發病機理上的差異限制了我們確定不再為人類提供臨床益處的治療時間的能力。然而,我們的研究提供的數據強烈支持在非人類靈長類動物中測試GS-5734,并建議,如果在治療過程中盡早給藥,用GS-5734對MERS-CoV感染的人進行治療將有助于減少病毒復制和疾病感染。


目前,尚無針對SARS-或MERS-CoV的經過批準的抗病毒治療劑可專門針對該病毒。目前正在開發針對SARS和MERS-CoV的多種治療方法,包括免疫調節,疫苗接種,直接作用抗病毒藥(DAA)和靶向宿主的抗病毒藥(7)。已知的抗病毒藥如病毒唑和洛匹那韋-利托那韋,以及免疫調節劑如干擾素和皮質類固醇已被用于治療SARS和MERS-CoV患者,但在隨機對照試驗中均未證明有效(7)。幾種FDA批準的藥物(利托那韋,洛匹那韋,奈非那韋,霉酚酸,和利巴韋林),但矛盾的結果和實驗不協調使得難以解釋(在多種細胞系的細胞培養研究已經證明抗病毒作用24 - 29)。小分子靶向SARS-和MERS-CoV的已評估在體外的癌癥細胞系,但它們對其它人或人畜共患冠狀病毒的抗病毒效力仍然是未知的(16,30)。極少數小分子已在病毒致病的冠狀病毒的動物模型進行了評估,有的甚至被證明加劇疾病(例如利巴韋林,霉酚酸)(31,32)。雖然Ces1c本文使用的 -/-小鼠可增強藥物穩定性,因此不適合進行MERS-CoV功效研究,因為MERS-CoV受體的鼠直系同源物二肽基肽酶4(DPP4)不能促進MERS-CoV感染(33)。因此,我們的體內研究僅限于SARS-CoV,并且計劃評估MERS-CoV在雙轉基因人源化DPP4 /Ces1c -/-小鼠中的功效的未來研究。GS-5734的人體安全性測試正在進行中,根據“同等使用”條款,該藥物已用于治療少數感染埃博拉病毒的患者(34)。總的來說,我們的工作提供了證據,表明GS-5734可以保護被CoV感染的患者免于發展為嚴重疾病,可以在現有地方性MERS-CoV的地區預防性保護醫護人員,并且當新的CoV出現時,其廣譜活性可能被證明是有價值的在未來出現。

 
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